同位素稀释-亲水作用色谱串联质谱快速测定尿液中8-羟基脱氧鸟苷和可替宁的研究

  目的  建立尿液中8-羟基脱氧鸟苷和可替宁的同位素稀释-亲水作用色谱串联质谱的快速测定方法。  方法  离心后的尿样上清液加入15N₅-8-羟基脱氧鸟苷、D₃-可替宁两种内标,以3 mmol/L甲酸铵水溶液稀释5倍,经0.22 μm水系滤器过滤后,引入液相色谱-串联质谱法（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）分析。以ACQUITY UPLC? BEH HILIC色谱柱（50 mm×3.0 mm, 1.7 μm）分离,3 mmol/L甲酸铵水溶液与乙腈为流动相(10∶90) 等度洗脱,柱温40 ℃,流速0.3 mL/min;质谱以电喷雾电离源（electrospray ionization, ESI）+扫描多反应监测模式检测,内标法定量。  结果  8-羟基脱氧鸟苷和可替宁在各自线性范围内线性良好,方法检出限分别为0.064 μg/L和0.035 μg/L;定量限分别为0.21 μg/L和0.12 μg/L;加标回收率分别为92.6%～102.0%和102.0%～106.0%。采用所建立的方法测定实际尿样,并通过40例样本统计分析发现,主、被动吸烟者的烟草烟气暴露量、烟草特有亚硝胺摄入量存在差异（P<0.05）,NNAL和可替宁含量在主动吸烟者尿样中含量更高;主、被动吸烟者的烟草烟气暴露与烟草特有亚硝胺暴露呈正相关（其相关系数r分别为0.487和0.786,P<0.05）。  结论  本研究成功建立同时测定尿液中8-羟基脱氧鸟苷和可替宁含量的同位素稀释-亲水作用色谱串联质谱法,该方法前处理简单、快速,通过同位素内标校正,定量灵敏准确,能够满足批量分析的需求。     

嗜黏蛋白阿克曼菌对大鼠胰岛细胞瘤细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌功能的影响

  目的  探讨嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila, A. muciniphila）对大鼠胰岛细胞瘤细胞（INS-1）增殖、凋亡及胰岛素分泌功能的影响。  方法  将INS-1细胞分为正常组、修复组和保护组,每组均用3种A. muciniphila干预物（活菌、灭活菌和分泌物）处理48 h,并设不干预的空白对照。正常组INS-1细胞直接干预;修复组INS-1细胞先用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）造模再加干预物;保护组INS-1细胞先用干预物作用再加STZ造模。干预结束,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞增殖;使用葡萄糖刺激,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测胰岛素分泌水平;实时荧光定量PCR技术检测胰岛素分泌相关基因和凋亡基因表达,Western blot检测Bax凋亡蛋白的表达。  结果  A. muciniphila干预物对INS-1细胞作用48 h后,其细胞形态无明显变化。A. muciniphila活菌干预的修复组INS-1细胞增殖活性较空白对照降低（P<0.005）。A. muciniphila干预物对正常组、修复组和保护组INS-1细胞的胰岛素分泌没有影响（P>0.05）。A. muciniphila分泌物可促进正常组、修复组和保护组INS-1细胞葡萄糖转运蛋白2基因(glucose transporter 2, Glut2)和修复组葡萄糖激酶基因 (glucokinase, GCK)的表达（P<0.05）。3种A. muciniphila干预物处理后的正常组INS-1细胞Bcl₂-associated X基因 (Bax)的表达量减少（P<0.001）,A. muciniphila死菌干预的修复组INS-1细胞Bax基因表达量减少（P<0.05）。A. muciniphila干预物处理的细胞Bax蛋白表达减少。  结论  A. muciniphila可促进INS-1细胞胰岛素分泌相关基因的表达,抑制凋亡基因和凋亡蛋白Bax的表达,为研究如何用A. muciniphila改善2型糖尿病提供了新的方向。     

分散液-液微萃取结合气相色谱质谱测定尿液中的尼古丁和可替尼

目的 探讨建立溶剂去乳化分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME）结合气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass,GC/MS）测定尿液中尼古丁和可替尼的方法。方法 考察GC/MS检测和DLLME条件。取5 mL尿样,用NaOH调节pH至9.0,加入氯化钠振荡溶解后,取100 μL三氯甲烷（含内标物喹啉）和1 000 μL甲醇分别作为萃取剂和分散剂并混合,注入样液中使乳化分散,4 000 r/min离心5 min,弃上清,取1 μL下层有机相进GC/MS分析。以DB-5毛细管色谱柱为分离柱,程序升温分离样液中的尼古丁和可替尼,离子监测(SIM)模式质谱检测和内标工作曲线法进行定量。结果 尼古丁和可替尼在0.2~100 ng/mL范围内线性良好,方法检出限分别为0.010 ng/mL和0.022 ng/mL,方法精密度(相对标准偏差)分别为8.2%和9.6%,加标回收率分别为92.0%~108.0%和83.0%~110.0%。结论 本方法简单快速、灵敏准确,适用于尿液中尼古丁和可替尼的测定,能满足人群烟草暴露评价的需要。     

发酵乳增效治疗幽门螺杆菌的Meta分析

目的：系统评价发酵乳联合常规治疗方案清除幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)感染的临床疗效。 方法：通过检索Pubmed,Embase,中国知网,中国生物医学文献数据库,万方知网和维普等数据库,收集各数据库建库至2015年2月间与发酵乳辅助治疗H. pylori感染相关研究的随机试验或半随机对照试验,分析根除率与不良反应发生率的合并RR值,并进行亚组、敏感性分析和发表偏倚检测。结果：共纳入9项(1 644例)研究,发酵乳联合常规根除疗法与单独常规根除疗法H. pylori根除率分别为79.5%和67.0%,其合并RR为1.186(95%CI: 1.118~1.257)。总不良反应发生率的合并RR为0.706(95%CI: 0.373~1.340)。结论：益生菌可提高常规疗法对H. pylori的根除率,但不能有效降低不良反应的发生风险。     

结核分枝杆菌clpP2抗原表位预测与分析

【摘要】 目的 预测结核分枝杆菌酪蛋白酶蛋白水解亚基单位2（clpP2）的抗原表位,为结核病疫苗、药物研制等提供新的靶点。方法 以clpP2蛋白的氨基酸序列为基础,采用生物信息软件DNA Star预测二级结构;运用SWISS-MODEL在线软件进行同源建模;运用VaxiPred软件综合预测T 细胞抗原表位,用ABCpred、COBEPro和BepiPredPred 软件综合预测其B 细胞抗原表位;采用DNA Star Protean、SignalP、TMHMM在线软件和NCBI数据库分析其免疫学相关信息。结果 clpP2蛋白结构丰富,含有较多潜在细胞毒性T细胞和辅助T细胞表位; 也含有较多的B细胞线性和构象优势表位,这些区域亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。结论 clpP2蛋白具有诱导免疫应答的潜能,可以作为结核监测、治疗、预防的新靶点。     

绵羊李斯特菌载体结核疫苗株inlB1基因缺失减毒株的构建及评价

目的 对以绵羊李斯特菌（Listeriaivanovii,LI）为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性。方法 构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定减毒株LIΔinlB1-Ag85C和原始株LI-Ag85C的体外生长曲线;测定两株菌对于肝癌细胞系HepG2细胞的黏附、侵袭能力的影响,比较两株菌溶血能力的差异,两株菌对于小鼠的半数致死量（median lethal dose,LD50）差异。结果 敲除inlB1基因的重组结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C的基因序列符合预期结果。减毒株与原始株的体外生长情况基本一致;对于HepG2细胞的黏附率分别为6.66%和7.46%,侵袭率分别为0.031%和0.042%,减毒株的黏附、侵袭能力均低于原始株,但差异无统计学意义;减毒株的溶血活性较原始株无明显变化;对小鼠的LD50值分别为3.2×108 CFU/只和6.7×107 CFU/只,减毒株LD50相较于原始株明显提高。结论 成功构建inlB1基因缺失的新型结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C,其毒力较原始株降低。     

EMA-PCR技术快速鉴别死活腺病毒的初探

目的 探讨采用叠氮溴化乙锭（EMA）联合聚合酶链反应（PCR）快速鉴别死活腺病毒的方法。方法将不同稀释度的病毒接种至生长良好的单层细胞上,通过细胞病变效应（CPE）的发生情况计算病毒滴度;将3种腺病毒和新城疫鸡瘟病毒分别制备成106 PFU/mL的母液并梯度稀释备用,提取DNA后用PCR扩增后进行凝胶电泳,观察目的片段的扩增结果;分别用0 μg/mL、70 μg/mL、120 μg/mL和150 μg/mL的EMA处理灭活后的腺病毒,提取DNA进行PCR,观察目的片段的电泳结果;用120 μg/mL的EMA处理107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL、104 PFU/mL、103 PFU/mL的腺病毒,观察PCR和凝胶电泳结果。结果 104 PFU/mL及以上滴度的病毒DNA PCR后得到阳性条带,其他滴度的病毒DNA PCR后未检测到阳性条带;3个型别的腺病毒（共8个分离株）的DNA均扩增出目的条带,新城疫鸡瘟病毒的DNA未扩增出目的条带;120 μg/mL及150 μg/mL的EMA抑制灭活腺病毒DNA 扩增,未得到阳性条带;120 μg/mL EMA不影响107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL的腺病毒活病毒DNA扩增,得到阳性条带。结论 本研究证实EMA-PCR方法可快速鉴别死活腺病毒,能有效避免单纯PCR检测腺病毒产生的假阳性结果。     

高效液相色谱法同时测定市售醒酒护肝产品中9种天然功效成分的方法建立

目的 利用高效液相色谱法同时检测市售醒酒护肝产品中9种天然功效成分（葛根素、槲皮素、水飞蓟宾、五味子醇甲、姜黄素、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA）。方法 样品经体积分数为90%的乙醇超声提取,10 000 r/min离心10 min,取上清液进样,经C18柱用甲醇-水（用H3PO4调pH为2.5）进行梯度洗脱,柱温20℃,流速为0.8 mL/min。色谱峰保留时间定性,外标标准曲线法定量。 结果 在优化的条件下,9种组分在各自的线性范围内相关系数（ r）≥0.998,检出限和定量限分别为0.38～0.73 mg/kg〔信噪比（S/N）=3〕和1.27～2.43 mg/kg（S/N=10）,加标回收率为88.9%～103.2%,加标样品的相对标准偏差为1.3%～3.7%。结论 [本研究成功建立市售保健品中多类醒酒护肝功效成分的高效液相色谱同时测定方法,能够满足市售醒酒护肝产品的常规分析和质量评价要求。     

成都市售辣椒中产黄曲霉毒素菌株的分离及其基因分析

目的 从成都市售辣椒粉中,分离产黄曲霉毒素的菌株,探究产毒基因AflR、Omt-1和Ver-1与产黄曲霉毒素B1（AFB1）能力的关系。方法 采用传统培养法分离菌株,多重PCR方法筛查潜在产黄曲霉毒素菌株,对潜在产黄曲霉毒素菌株进行产毒培养,以ELISA方法检测潜在产毒株7 d产毒培养液中AFB1含量;同时基于潜在产毒株的产毒关键基因AflR、Omt-1和Ver-1构建系统进化树,分析其同源性。结果 64份辣椒样品中,分离到17株潜在产AFB1的黄曲霉菌株,有11株分离株产毒,产毒黄曲霉分离率为64.71%;且基于AflR、Omt-1和Ver-1基因与产毒标准菌株有较高同源性;有6株分离株不产毒,与米曲霉序列有较高同源性。结论 控制黄曲霉污染是黄曲霉控制中重要的环节之一。并非含有产毒基因的黄曲霉都会产AFB1毒素,产AFB1能力与产毒基因AflR的序列有着直接联系,而AFB1合成量的高低与Omt-1和Ver-1基因有关。     

紫外衍生-高效液相色谱法测定保健食品和饮料中的三氯蔗糖

目的 建立保健食品和饮料中三氯蔗糖的柱前紫外衍生-高效液相色谱测定方法。方法 样品经水浸提、离心后,取样液与苯甲酰氯在碱性介质中反应生成具有紫外吸收的衍生产物,然后用高效液相色谱法分析。色谱条件:分离柱为C18柱（250 mm×4.6 mm,4 μm),流动相为甲醇-水( 95∶5,V/V),检测波长为232 nm。以保留时间定性,标准曲线法定量。 结果 三氯蔗糖在0.05～1.00 μg范围内,与色谱峰面积有良好的线性关系（r=0.999 8）,方法检出限为0.001 25 μg。方法加标回收率为97.4%～102.0%,相对标准差均小于5.0%,方法的日内精密度和日间精密度分别为1.52%和4.04%。结论 该方法简便快速、分离效果好,准确度高,不需要特殊检测器,适用于保健食品和饮料中三氯蔗糖的快速测定。